Aquesta entrada és força estranya. Ara mateix estic redactant la memòria de la beca de l'AECC la qual m'ha permès passar mig estiu a un gran centre de recerca, l'Idibell, al grup d'en Manel Esteller.
Esta entrada es bastante extraña. Ahora mismo estoy redactando la memoria de la beca de la AECC la que me ha permitido pasar medio verano en un gran centro de investigación, el Idibell, en el grupo de Manel Esteller.
Com que vaig just d'espai a la memòria esmentada, permeteu-me emprar el meu blog per penjar les imatges suplementàries d'aquesta. Aprofitarè però per explicar-vos com es pot determinar la metilació d'una regió d'ADN, clau en els estudis d'epigenètica:
Como no tengo demasiado espacio en la memoria mencionada, permítanme utilizar mi blog para colgar las imágenes adicionales de esta:
Figura suplementaria 1: Fundamento de la conversión con bisulfito. A. Distintas fases de la reacción que desencadenan la conversión de citosina en uracilo. B. Esquema de cambios en secuencias tratadas con bisulfito en función del estado de metilación. La secuencia superior mantiene las citosinas metiladas, mientras que en la secuencia inferior han sido substituidas por timinas.
Conversió de bisulfit
El bisulfit és un compost capaç de reaccionar específicament amb la citosina, una de les quatre bases que formen el DNA. La reacció de sulfonació contínua amb una desaminació hidrolítica. Finalment es produeix una desulfonación alcalina. Aquestes reaccions donen lloc a la transformació de la citosina en uracil (Fig. 1A). Aquest mètode es pot utilitzar per conèixer el patró de metilació d'un gen, ja que la reacció explicada no pot donar-se quan la citosina es troba metilada (Fig. 1B). Després de la conversió es poden dur a terme diferents tècniques que ens permetin estudiar el patró de metilació, durant la meva estada es van fer:
MSP (Methyl specific PCR)
És un mètode que ens permet conèixer la metilació d'un gen. Després de la conversió de bisulfit cada mostra va ser sotmesa a dos PCR que diferien entre si pels primers utilitzats. Una parella de primers era complementària a la seqüència inicial, mentre que una altra era complementària a una seqüència convertida. Després de la PCR les mostres van ser corregudes en un gel, on es va poder saber de forma qualitativa si el gen problema en aquesta mostra en concret estava o no metilat, en funció de la presència o absència de banda.
Seqüenciació
Aquest mètode concedeix una informació més quantitativa del perfil de metilació de cada regió del gen problema en cada línia. La regió d'interès del DNA convertit és amplificat mitjançant PCR. El producte de PCR va ser purificat i lligat en un vector pGEM-T easy i transformat en E. coli competents sembrades en un medi LB AMP amb IPTG i X-GAL. Donades les característiques del vector i les substàncies afegides al medi es van poder seleccionar els bacteris positives. Els bacteris que no van ser transformades no van sobreviure a causa de la falta de resistència a ampicilina. Els bacteris que recircularizaron el plàsmid eren blaus (al recircularizarse pGEM-T easy es forma el gen de la B-galactosidasa, que en reaccionar amb IPTG i X-Gal dóna una coloració blava), mentre que colònies de bacteris que van captar el plasmidi amb l'insert seran blanques (en haver-se fragmentat el gen de la B-Gal). Després picar les colònies positives, es va extreure i es va purificar el DNA plasmídic a través d'un kit de Miniprep. Després d'això es va fer la PCR de seqüenciació pel mètode de Sanger.
Figura suplementaria 2: Estructura del constructo de pLVX-GFP
Cap comentari:
Publica un comentari a l'entrada